Science | 哈佛医学院团队应用AlphaFold-Multimer揭示一种名为 DONSON 的神秘蛋白质功能

编辑 | 白菜叶

CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) 解旋酶组装是真核细胞复制起始的核心事件。在酵母中，多亚基「预加载复合物」(pre-LC) 伴随 GINS 到达染色质结合的 MCM2-7，导致 CMG 形成。

哈佛医学院（Harvard Medical School）的研究团队报道 DONSON（一种在小头型原始侏儒症中发生突变的后生动物蛋白）是脊椎动物 CMG 组装所必需的。使用 AlphaFold 筛选蛋白质-蛋白质相互作用，然后进行实验验证；结果表明 DONSON 支架了包含 GINS、TOPBP1 和 DNA pol ε 的脊椎动物 pre-LC。

该团队的证据表明，DONSON 将预 LC 对接至 MCM2-7，将 GINS 递送至 CMG 中的结合位点。源自患者的 DONSON 突变会损害 CMG 组装并重现小鼠小头侏儒症。这些结果统一了研究人员对真核复制起始的理解，暗示了小头侏儒症中存在缺陷的 CMG 组装，并说明了计算机蛋白质-蛋白质相互作用筛选如何加速机制发现。

该研究以「

In silico protein interaction screening uncovers DONSON’s role in replication initiation

」为题，于 2023 年 8 月 17 日发布在《

Science

》

快速而忠实的 DNA 复制维持了基因组的完整性，但在癌症等人类疾病中经常被破坏。复制起始过程中的一个关键事件是 CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) 解旋酶的组装，该解旋酶在分叉处解旋 DNA，由六聚体 MCM2-7 ATP 酶和两个辅助因子 CDC45 和 GINS 组成。MCM2-7 双六聚体被募集到 G1 起始点且细胞进入 S 期后，CDC45 和 GINS 依次与 MCM2-7 双六聚体结合，导致 CMG 组装。

在酵母中，GINS 被包含 Dpb11、Sld2 和 DNA 聚合酶 ε (Pol ε) 的「预加载复合物」(pre-LC) 护送至 MCM 双六聚体，但 GINS 如何被招募到后生动物的起源仍不清楚。此外，多细胞生物体含有 SON 下游邻居 (DONSON) 等蛋白质，它们通过未知机制影响复制。

科学家想了解在小头侏儒症中发生突变的 DONSON 如何促进 DNA 复制。为此，哈佛医学院的研究人员结合了生物化学、细胞生物学、小鼠遗传学和计算机筛选新的蛋白质-蛋白质相互作用。

他们首先从无细胞非洲爪蟾卵提取物中去除了 DONSON，它概括了基因组维护过程。研究人员发现，在没有 DONSON 的情况下，DNA 复制和 CMG 组装被废除。使用可诱导的 DONSON 降解决定子等位基因，发现 DONSON 对于人类细胞中的 CMG 组装和 DNA 复制也至关重要。

为了探索 DONSON 如何促进 CMG 形成，该团队使用 AlphaFold-Multimer (AF-M) 在整个复制体中搜索 DONSON 相互作用蛋白。通过计算机筛选确定了 GINS、TOPBP1（Dpb11 直系同源物）、POLE2（Pol ε 亚基）、MCM3（MCM2-7 亚基）和 DONSON 本身为高置信度 DONSON 相互作用因子。

基于这些预测，研究人员假设 DONSON 支架了一个二聚体脊椎动物 pre-LC，其中包含两个 DONSON、TOPBP1、GINS 和 Pol ε 拷贝，并且该 pre-LC 将 GINS 定位在 CDC45-MCM2-7 上以进行 CMG 组装。与该模型一致，生化研究证实 DONSON 与 TOPBP1 和 GINS 的相互作用对于 CMG 形成和 DNA 复制至关重要。

另一方面，DONSON 与 MCM3 的相互作用对于预 LC 组装来说是可有可无的，而是促进了预 LC 对接至 MCM 双六聚体。导致人类小头侏儒症的 DONSON 突变在小鼠身上重现了这种情况，并损害了复制启动和 CMG 组装。

最后，当研究人员使用 AF-M 和其他标准筛选整个人类蛋白质组中的 DONSON 相互作用子时，CMG 组装因子高度富集，这表明从头开始进行蛋白质功能鉴定的计算机筛选的潜力。

研究人员将 DONSON 确定为脊椎动物 CMG 组装所需的因子。它通过组织预 LC 发挥作用，将 GINS 传递到 CDC45-MCM2-7 上的结合位点，从而导致 CMG 组装。结果表明，尽管所有真核生物都含有前 LC，但它们的结构不同，脊椎动物使用 DONSON 而不是 Sld2。另外，CMG 组装缺陷与小头侏儒症的病理生理学有关。研究人员认为，复制起始受损会导致细胞周期进展缓慢，从而导致这种侏儒症中出现的细胞减少。使用 AF-M 进行大规模计算机蛋白质-蛋白质相互作用筛选是识别功能相关相互作用和制定可测试的分子假设的有效方法。

论文链接：

https://www.science.org/doi/full/10.1126/science.adi3448